Modelo in vitro de parkinsonismo experimental induzido por rotenona: investigação de mecanismos de ação, neuroproteção e morte celular

Evidências crescentes na literatura têm sugerido papel importante para os fatores ambientais, como a exposição a pesticidas, na patogênese da doença de Parkinson. Em animais experimentais, a exposição à rotenona, um pesticida e piscicida de uso comum, induz características de parkinsonismo através da inibição do complexo I mitocondrial. O objetivo deste estudo foi investigar a morte de neurônios induzida por rotenona utilizando culturas primárias mistas neurônio/glia derivadas de hipocampo e de mesencéfalo ventral de ratos, bem como o papel do Ca2+ na neste modelo experimental e a utilização de extrato aquoso de folhas de mogno com substâncias com alto poder antioxidante. A perda neuronal foi analisada com ensaios colorimétricos (MTT e LDH). Nossos resultados mostraram significativa redução na viabilidade celular após exposição à rotenona de maneira dependente de concentração, mas não dependente de tempo. Foi observada igual e elevada suscetibilidade em culturas mistas neurônio/glia derivadas de hipocampo e de mesencéfalo ventral ao agente neurotóxico. Em termos mecanicísticos, nossos resultados mostraram um papel discreto desempenhado pelo Ca2+ mitocondrial na neurodegeneração induzida por rotenona. Além disso, neste paradigma utilizado, verificamos que o extrato aquoso de folhas de mogno não promoveu proteção contra a toxicidade da rotenona, na concentração testada; ainda, promoveu efeito sinérgico em associação com rotenona. Verificou-se ainda que a rotenona, bem como o extrato de mogno promoveu indução de morte celular tanto por necrose quanto por apoptose, nas concentrações utilizadas. Os resultados deste estudo devem avançar nosso conhecimento sobre o mecanismo de ação de fatores ambientais na patogênese da doença de Parkinson.

Diagnóstico citológico e molecular da infecção pelo HPV em mulheres do município de Barcarena, Pará, Norte do Brasil

O HPV (Papilomavírus humano) foi apontado pela OMS (Organização Mundial de Saúde - WHO) como principal fator de risco para o desenvolvimento do câncer de colo uterino, tornando-se assim um importante e gravíssimo problema de saúde pública, especialmente nos países subdesenvolvidos ou em desenvolvimento. A precocidade das atividades sexuais, múltiplos parceiros e sexo casual, o tabagismo, a imunossupressão (por exemplo, na população de pacientes aidéticos), gravidez, doenças sexualmente transmissíveis prévias como herpes e clamídia, além do não cumprimento das medidas já adotadas como prevenção de Doenças Sexualmente Transmissíveis (DST), como por exemplo, o simples uso de preservativos, está reconhecidamente associado à incidência da infecção por HPV. Essa pesquisa teve como objetivo avaliar o desempenho diagnóstico das metodologias de citologia convencional (Exame de Papanicolau) em relação à citologia em base líquida, além de determinar a prevalência dos genótipos 16 e 18 do HPV em mulheres sem efeito citopático compatível com HPV e relacionar a presença de quadros inflamatórios, associados ou não ao HPV, com dados epidemiológicos como idade, escolaridade, condição sociocultural de mulheres provenientes do município de Barcarena – Pará – Brasil. Para tanto, participaram deste estudo, voluntariamente, 50 mulheres atendidas na Unidade de Saúde de Barcarena – Pará, através de campanha para coleta de Exame de Papanicolau como método de prevenção de câncer do colo do útero. Estas mulheres receberam informações referentes a todos os procedimentos realizados pelo corpo de saúde deste estudo e aos resultados desta pesquisa e somente após as voluntárias terem assinado o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, as mesmas foram incluídas para as coletas de amostras. As análises e os resultados dos testes de citologia de base líquida e convencional foram realizados segundo a Classificação de Bethesda e revisados cegamente por dois citopatologistas. Para a análise estatístca foi utilizado o teste exato de Fisher e o "Screening Test" visando determinar a especificidade/ sensibilidade dos métodos, considerando significativo o valor de p ≤ 0,05. Como resultado, observamos que o uso da citologia de base líquida tem demonstrado uma série de vantagens em relação à citologia convencional. No diagnóstico molecular (PCR) foram observadas ocorrências de HPV dos tipos 16 e 18 em 10% das mulheres atendidas. Dentre os casos que apresentaram PCR positivo para os tipos 16 ou 16/18 a maioria das mulheres tinham 27,4 anos de idade em média; com maior escolaridade; que exercem atividades domésticas e rurais; e com ocorrências de co-infecção por agentes infecciosos causadores de outras doenças sexualmente transmissíveis. Os resultados obtidos neste estudo reforçam a importância da manutenção de campanhas gratuitas de prevenção do câncer de colo do útero como uma medida preventiva no combate desta doença, principalmente no Estado do Pará onde, provavelmente, o perfil epidemiológico da doença está associado às grandes distâncias que as mulheres de comunidades ribeirinhas têm que percorrer para realizar este exame de forma gratuita; ao tipo de atividade econômica da região; ao preconceito local ainda existente com o exame; e ao grau de dificuldade de implementação de ações efetivas de retorno das pacientes às consultas médicas após a obtenção do resultado do exame e mesmo o encaminhamento para diagnóstico molecular dos casos positivos para lesões do tipo ASC-H e NIC I, II e III.

Determinação do ciclo estral em catetos Pecari tajacu: aspectos colpocitológicos e clínicos

Este trabalho teve por objetivo estudar o ciclo estral do cateto, aplicando a colpocitologia como método diagnóstico. As amostras da citologia vaginal foram coletadas em dez fêmeas adultas, durante três vezes na semana, por seis meses. Verificou-se que a duração média do ciclo estral para esta espécie foi de 28,45 ± 5,45 dias. Observou-se diferença estatística (p<0,01) em relação à frequência dos diferentes tipos celulares na mesma fase do ciclo estral. No proestro foi verificado o aumento de células intermediárias e superficiais. A fase de estro caracterizou-se pela elevação significativa de células superficiais em relação aos demais tipos celulares e pela ausência de leucócitos. Durante este período, a genitália externa estava hiperêmica, edemaciada e com muco. No metaestro houve um decréscimo de células superficiais, quando comparado com o proestro e com o estro, e uma elevação significativa de células intermediárias, presença de leucócitos, de células de metaestro e de foam. Na fase de diestro, houve um aumento de células intermediárias, e um decréscimo no número de leucócitos. Conclui-se que, por meio da colpocitologia, é possível diferenciar as fases do ciclo estral em catetos.

Exposição à concentração subletal de metilmercúrio: genotoxicidade e alterações na proliferação celular

O mercúrio é um metal que se destaca dos demais por se apresentar líquido em temperatura e pressão normais. Este xenobiótico se apresenta como a maior fonte de poluição em várias partes do mundo e tem como característica ser altamente tóxico ao Sistema Nervoso Central (SNC). O despejo é na forma líquida diretamente no solo e leito dos rios. Este metal pesado é complexado com vários elementos presentes no solo ou sedimentos sendo convertido à metilmercúrio (MeHg) pela microbiota aquática. O MeHg apresenta a capacidade de se acumular ao longo da cadeia trófica, um evento conhecido como biomagnificação, o qual afeta diretamente a vida humana. Nesse sentido, a Região Amazônica se destaca por possuir todos os componentes necessários para a manutenção do ciclo biogeoquímico do mercúrio, além de populações cronicamente expostas a este metal pesado, sendo este fato considerado um problema de saúde pública. Tem-se conhecimento que este xenobiótico após a exposição aguda a altas doses promove desordens relacionadas ao surgimento de processos degenerativos no SNC, entretanto, os efeitos a baixas concentrações ainda não são totalmente conhecidos. Nesse sentido, se destacam as células gliais que atuam como mediadores no processo de neurotoxicidade desse metal, principalmente em baixas concentrações. Apesar de este tipo celular exibir um importante papel no processo de intoxicação mercurial, a ação deste metal sobre as células glias é pouco conhecida, principalmente sobre o genoma e a proliferação celular. Desta forma, este trabalho se propõe a avaliar o efeito da exposição a este xenobiótico em baixa concentração sobre o material genético e a proliferação celular em células da linhagem glial C6. As avaliações bioquímica (atividade mitocondrial – medida pelo ensaio de MTT –) e morfofuncional (integridade da membrana – avaliada pelo ensaio com os corantes BE e AA –) confirmaram a ausência de morte celular após a exposição ao metal pesado na concentração de 3 μM por um intervalo de 24 horas. Mesmo sem promover processos de morte celular, o tratamento com esta concentração subletal de MeHg foi capaz de aumentar significativamente os níveis dos marcadores de genotoxicidade (fragmentação do DNA, formação de micronúcleos, pontes nucleoplásmica e brotos nucleares). Ao mesmo tempo, foi possível observar uma alteração no ciclo celular através do aumento do índice mitótico e uma mudança no perfil do ciclo celular com aumento da população celular nas fases S e G2/M, sugerindo um aprisionamento nessa etapa. Esta mudança no ciclo celular, provocada por 24h de exposição ao MeHg, foi seguida de uma redução no número de células viáveis e confluência celular 24h após a retirada do MeHg e substituição do meio de cultura, além do aumento no tempo de duplicação da cultura do mesmo. Este estudo demonstrou pela primeira vez que a exposição ao metilmercúrio em concentração baixa e subletal é capaz de promover eventos genotóxicos e distúrbios na proliferação celular em células de origem glial.

Envelhecimento e doenças neurodegenerativas crônicas na Amazônia brasileira: implantação de novas metodologias de avaliação em pacientes com declínio cognitivo leve e doença de Alzheimer

Em 2025 o número de idosos no mundo irá dobrar e por volta de 2050 alcançará dois bilhões de indivíduos, estando a maioria em países desenvolvidos. A doença de Alzheimer (DA) é a quarta doença que mais compromete a qualidade de vida dos idosos. Este trabalho pretende sugerir novas metodologias de avaliação de pacientes com declínio cognitivo e doença de Alzheimer, apresentando uma versão brasileira a partir da versão original em língua inglesa intitulada “Test Your Memory” TYM (“teste sua memória- TSM), bem como mostrar os resultados do desempenho dos idosos na bateria de testes neuropsicológicos de Cambridge (CANTAB). Trata-se de estudo analítico, transversal retrospectivo do tipo caso-controle, realizado em pacientes do ambulatório de Geriatria do Hospital Universitário João de Barros Barreto, e em voluntários da comunidade no período de janeiro de 2009 a janeiro de 2011. Participaram 95 indivíduos com 65 ou mais anos de idade, divididos em 3 grupos: Alzheimer (DA, n=21), declínio cognitivo (DCL, n=31) e controle (n=43). Foram excluídos pacientes com história de acidente vascular encefálico (AVE), depressão primária, trauma cranioencefálico, outras demências, outras patologias neuropsiquiátricas e déficits visuo-auditivos limitantes. Os participantes foram submetidos à avaliação inicial, triagem com GDS-5 e DSM-IV, ao Questionário Internacional de Atividades Físicas (IPAQ), testes neuropsicológicos da bateria CERAD, teste do relógio, TSM (versão adaptada para o Português) e a bateria de Alzheimer do CANTAB. A análise estatística foi realizada empregando-se ANOVA, um critério, definindo-se o valor p<0,05 como significante. Houve predomínio em todos os grupos de indivíduos do gênero feminino, de cor parda, na faixa etária de 70 a 79 anos. A média de pontuação do MEEM entre os três grupos foi diferente (controle: 26,6±2,2; DCL: 25,1±2,6; DA: 17,3±4,9; p<0,05), entretanto o TSM mostrou ser uma ferramenta de triagem mais confiável para distinguir os pacientes DCL dos DA (controle: 42,4±5; DCL: 35,5±7,7; DA: 25,7±8; p<0,01). Na lista de palavras do CERAD, teste do relógio, TNBR e na fluência verbal fonológica os três grupos apresentaram diferenças significantes na média de pontos obtidos. A média da pontuação total no TSM foi significativamente menor nos grupos DCL e DA do que no grupo controle, e no grupo DA em relação ao DCL. Os testes e medidas do CANTAB que separam os três grupos pelo desempenho obtido são: RVP A‟, número de tentativas para o sucesso e total de erros na fase de 6 figuras do PAL. Foram encontradas boas correlações entre o TSM e outros testes, principalmente com o MEEM (Coeficiente de Pearson, r = 0,79; p<0,0001) e teste do relógio (r = 0,76; p<0,0001), bem como boa correlação entre as medidas do PAL e a pontuação do TSM e o MEEM. O nível de atividade física no grupo controle foi maior do que em todos os outros grupos. Ao ser correlacionado o nível de atividade física e o desempenho nos testes cognitivos, não foram observadas diferenças significativas nos diferentes grupos, exceto pela evocação de palavras no grupo DCL. Tomados em conjunto os resultados sugerem que a aplicação de testes neuropsicológicos automatizados associados aos testes da rotina clínica e ao TSM aumentam a resolução e a confiabilidade das análises particularmente no estágio inicial das síndromes demenciais onde a precocidade e a precisão diagnóstica são fundamentais para orientar as ações terapêuticas, sejam elas medicamentosas e/ou comportamentais.

Impacto da mistura de amaranto adicionada de arroz na proporção de 30/70% sobre a defesa antioxidante de ratos desnutridos

A desnutrição, altamente prevalente em países em desenvolvimento, é um mau antigo que aflige a humanidade. Apresenta-se como um estado de deficiência alimentar, com déficit global de proteínas e calorias, provocando menor aporte de nutrientes às células. Alguns estudos têm mostrado evidências de interação entre desnutrição e estresse oxidativo, ocasionado pelo acúmulo de espécies reativas de oxigênio que causam danos à estrutura das biomoléculas em decorrência da desregulação entre a produção de oxidante e a depleção das defesas antioxidantes. Nesse estudo foi avaliada a utilização da farinha instantânea de amaranto adicionada de arroz na proporção de 30/70% como suplemento alimentar da dieta de base do paraense usada como modelo de indução da desnutrição experimental em ratos sobre o estresse oxidativo dos animais desnutridos comparados aos controles e aos tratados com a dieta suplementada. A dieta modelo de desnutrição (DBR-PA) foi confeccionada respeitando-se as quantidades dos alimentos consumidos rotineiramente pela população do Pará, segundo inquérito alimentar realizado na década de 70 por pesquisadores da Universidade Federal do Pará, enquanto que, a dieta utilizada como tratamento foi elaborada adicionando-se a DBRPA 30% da farinha de amaranto. As análises da composição centesimal e o perfil de aminoácidos foram realizados de acordo com as normas do Instituto Adolfo Lutz (1995) e por espectrofotometria atômica. A dieta controle foi utilizada na forma que é comercializada. Para realização do estudo utilizou-se animais no pós parto imediato de mães alimentadas na gestação com dieta controle para ratos (22% de proteínas), com peso mínimo de 6 g ao nascer. No pós parto imediato as ratas mães foram divididas em 3 grupos a saber: grupo controle (22% de proteínas); grupo desnutridos (DBR-PA contendo 7,8% de proteínas) grupo 3 tratados (DBR-PA+AA) suplementada com a farinha instantânea de amaranto contendo 11,33%). No pós desmame os animais foram separados e em gaiolas individuais receberam a dieta materna específica de cada grupo até os 60 dias de vida, quando foram sacrificados e realizada a coleta de sangue para as dosagens bioquímicas (colesterol total e frações, valores hemogramas (hematimetria, leucograma e plaquetas), níveis de peroxidação lipídica e atividade da catalase. Após a coleta do sangue os animais foram submetidos à exerese do fígado para posterior análise histopatológica. Os resultados revelaram que a dieta indutora da desnutrição é um modelo de desnutrição grave comum na região norte, é hipoproteica, normocalórica, com aminoácido limitante (metionina), promoveu perda de peso nos animais desde o período de aleitamento com acentuado perda de peso nas ratas mãe e nos filhotes aos desmame (21 dias), aos 28 e 60 dias de vida (p <0,05) quando comparados aos animais tratados com amaranto e aos controles. A dieta suplementada com a farinha extrusada de amaranto promoveu ganho de peso no período do aleitamento tanto nas ratas mães (p<0,05) como nos filhotes a partir do 14º dias de uso da mesma ( p<0,05), aos 21 dias (desmame)(p<0,05) aos 28 ( p< 0,05)e 60º dias de vida (p<0,05). Os animais desnutridos consumiram mais dieta em todos os momentos avaliados quando comparados aos tratados e controles (p<0,05). Não foi observada diferença entre os grupos nos valores bioquímicos de hematimetria, leucograma, plaquetas, colesterol total e frações. Os níveis de peroxidação lipídica não apresentaram diferença estatística entre os grupos. A atividade da catalase foi maior no grupo tratado com a suplementação da farinha de amaranto quando comparado aos desnutridos.Os animais tanto os tratados com amaranto como os desnutridos apresentaram esteatose hepática e processo inflamatório dos hepatócitos.O estudo mostrou que a desnutrição imposta não ocasionou estresse oxidativo, porém a diminuição da atividade da catalase nos animais desnutridos pode ter sido ocasionado pela diminuição da síntese da catalase.

Avaliação in vitro do efeito genotóxico e neurotóxico da rotenona em populações neuronais de encéfalo de ratos

A doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa, que afeta principalmente neurônios dopaminérgicos da substância negra que projetam para o estriado. A rotenona, um composto amplamente usado como pesticida, pode estar relacionada a influências ambientais que aumentam o risco do aparecimento da DP. Estudo com análise de danos no DNA, como o ensaio em eletroforese do cometa foi introduzido neste trabalho para uma melhor compreensão de efeitos neurotóxicos da rotenona em modelo experimental da DP. O teste do cometa foi aplicado em neurônios provenientes de culturas mesencefálicas mistas de ratos expostas a diferentes concentrações em dois tempos de exposição, 24 e 48 horas. A média do índice de dano dos cometas mostrou-se, segundo análise estatística, significativamente diferente em relação ao grupo controle em todas as concentrações de rotenona testadas e nas duas durações analisadas. No entanto, na análise comparativa do índice de dano considerando o tempo de exposição para concentrações equivalentes, somente 20 e 30 nano molares demonstraram diferença significativa entre 24 e 48 horas de exposição. Este trabalho demonstrou que, nas condições empregadas, o teste do cometa detectou danos no material genético sem alteração detectável no teste de viabilidade celular pelo MTT (5 nM de rotenona por 24h), sugerindo que alterações genotóxicas podem anteceder alterações de viabilidade celular em neurônios expostos à rotenona. Entretanto, não é possível afirmar se tais alterações possuem caráter irreversível ou não.

Análise comportamental e histológica de um modelo animal da doença de Parkinson em camundongos suíços

A Doença de Parkinson (DP) é uma das doenças neurodegenerativas mais comuns relacionadas com a idade, e apresenta sintomatologia com alterações motoras clássicas que estão relacionadas com a degeneração dos neurônios dopaminérgicos da SNpc e a diminuição de dopamina no estriado. Modelos animais da DP são instrumentos importantes utilizados por pesquisadores para uma maior compreensão de mecanismos patológicos envolvidos na doença e para a avaliação de possíveis intervenções terapêuticas. Tais modelos devem mimetizar algum aspecto da doença, como a degeneração dos neurônios dopaminérgicos nigrais. Neste contexto, o modelo da DP induzido pela injeção da neurotoxina 6- hidroxidopamina (6-OHDA) já se encontra bem estabelecido em ratos, mas necessita ainda de melhor caracterização das alterações comportamentais e lesões no sistema nigro-estriatal em camundongos de diferentes linhagens a fim de que haja interpretações confiáveis quando o modelo for usado em testes terapêuticos. O presente estudo teve como objetivo melhorar a caracterização do modelo unilateral da DP com 6-OHDA em camundongos suíços, avaliando alterações comportamentais e o efeito sobre os neurônios dopaminérgicos da SNpc. Nesta investigação utilizou-se uma única injeção intraestriatal unilateral de 6-OHDA, em duas diferentes concentrações da toxina: 5µg/µl e 10µg/µl. Os nossos resultados mostraram que ambas as concentrações utilizadas causaram perda severa de neurônios dopaminérgicos na SNpc, com uma média de 74,5% e 89,5% de per da, respectivamente. Esta perda apresentou uma correlação alta com o comportamento rotatório induzido por apomorfina e uma correlação baixa com a ambulação no teste do campo aberto. Desta forma, injeções intraestriatais de 5µg/µl ou 10µg/µl de 6-OHDA, em camundongos suíços, reproduzem de forma efetiva o modelo animal unilateral da DP com 6-OHDA, podendo ser utilizadas de forma confiável em experimentos que visem a investigação de terapias farmacológicas, celulares e/ou de neuroproteção para a DP.

Metilmercúrio e mercúrio inorgânico em peixes comercializados nos mercado municipal de Itaituba (Tapajós) e mercado do Ver-o-peso (Belém)

O mercúrio é um perigoso metal e uma importante fonte de contaminação ambiental no Brasil e sobretudo na Amazônia. O principal órgão-alvo deste metal é o SNC onde causa danos que podem levar aos sintomas clássicos: ataxia, parestesia, disartria e alterações no desenvolvimento do sistema nervoso de crianças. A contaminação mercurial nos rios amazônicos aumenta a quantidade encontrada nos peixes, principalmente os que estão no topo da cadeia alimentar, expondo dessa forma a populações ribeiras à intoxicação mercurial, uma vez que o peixe é um elemento central na dieta dessas populações. Por isso, é fundamental o monitoramento periódico dos níveis de mercúrio nas espécies de peixes consumidas nessa região. Nosso trabalho se propôs a identificar os níveis de metilmercúrio e mercúrio inorgânico nas espécies de peixes mais consumidas pelas populações ribeirinhas da região do Tapajós e comparálos com os níveis encontrados em peixes da mesma espécie obtidos na região de Belém. Além disso, realizar uma comparação com os resultados obtidos por Dos Santos et al. (2000) e analisando os nível atuais e os antigos. Os peixes foram coletados no mercado municipal de Itaituba, no Tapajós, e no mercado do Ver-o-peso, em Belém. Amostras de músculo de cada peixe foram liofilizadas e analisadas pela Universidad de Castilla-La Mancha (Espanha) para quantificação do metilmercúrio e do mercúrio inorgânico. Os resultados obtidos no presente trabalho mostraram que somente os peixes piscívoros da região do Tapajós apresentam níveis de metilmercúrio acima do limite preconizado pela OMS (0,5 μg/g). Em todos todos os grupos do estudo, os níveis de mercúrio inorgânico estão bem abaixo deste limite. A espécie mais contaminada foi a Brachyplatystoma flavicans (dourada) chegando a ultrapassar até cinco vezes o limite de tolerância da OMS. Com nossos dados, pode-se dizer que os peixes da região do Tapajós continuam atualmente expostos a altas concentrações de mercúrio. As espécies não-piscívoras tiveram baixas concentrações de mercúrio orgânico, sendo aptas para consumo humano. O presente estudo apoia a importância do monitoramento continuado dos ambientes considerados expostos e não expostos na Amazônia. O conhecimento originado por este monitoramento fomentará definitivamente o desenvolvimento de estratégias de prevenção e de ações governamentais perante o problema da contaminação mercurial na Amazônia.

Valores normativos para o eletrorretinograma de campo total

Muitos laboratórios de eletrofisiologia visual não possuem seus próprios valores de normalidade para o eletrorretinograma de campo total. Isto prejudica a confiabilidade dos diagnósticos de diversas doenças que afetam as vias visuais. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi estabelecer os valores normativos para o teste Eletrorretinograma de Campo Total para o Laboratório de Neurologia Tropical (LNT) da Universidade Federal do Pará (UFPA). Realizaram o eletrorretinograma 68 indivíduos saudáveis e sem queixas visuais divididos em três grupos de acordo com a faixa etária: 36 indivíduos pertenceram ao grupo 1 (entre 17 e 30 anos), 21 indivíduos ao grupo 2 (entre 31 e 45 anos) e 11 indivíduos ao grupo 3 (entre 46 e 60 anos). O protocolo de realização do teste seguiu as recomendações da ISCEV, com a utilização de seis tipos de estimulação. Quatro após adaptação escotópica e estimulação com intensidades de: 0,01 cd.s/m2 (resposta de bastonetes), 3,0 cd.s/m2 (resposta mista de cones e bastonetes e potenciais oscilatórios) e 10,0 cd.s/m2 (resposta mista adicional). Dois após adaptação fotópica em fundo de 30 cd/m2: 3,0 cd.s/m2 (resposta de cones e Flicker 30Hz). Para a análise dos resultados foram calculados os valores de amplitude e tempo implícito das ondas a e b obtidas em resposta a cada um dos seis tipos de estimulação utilizados. Estes valores foram descritos estatisticamente através da mediana, intervalos de confiança, 1º e 3º quartis, coeficiente de variação, média, desvio padrão e valores mínimos e máximos. Os grupos de maior faixa etária apresentaram menores valores de amplitude e atraso no tempo implícito. A utilização da transformada wavelet permitiu a melhor visualização das ondas sem alteração de amplitude e tempo implícito. Portanto, os valores normativos obtidos podem servir como parâmetros de normalidade confiáveis para auxiliar o diagnóstico de doenças retinianas.

A influência do sistema nitrérgico no cultivo in vitro de embriões bovinos

O Óxido Nítrico (NO-) é uma molécula de sinalização celular que regula o desenvolvimento embrionário pré-implantacional. Nós investigamos o papel do NO- no cultivo de embriões bovinos produzidos in vitro, através do uso de N-Nitro-L-Arginina Metil Ester (L-NAME), um inibidor da produção de NO-, e L-arginina (ARG), um precursor de NO-, em diferentes períodos de cultivo (ativação do genoma embrionário e compactação). Foram avaliados seus efeitos sobre as taxas de desenvolvimento, cinética do desenvolvimento, qualidade embrionária, e expressão gênica. Os embriões foram produzidos por maturação e fertilização in vitro de oócitos aspirados de ovários provenientes de abatedouro frigorífico. No experimento 1, as taxas de desenvolvimento foram avaliadas em SOFaa na presença de L-NAME em diferentes períodos: do 1º ao 4º dia de cultivo (LN1-4), do 4º ao 8º (LN4-8) e do 1º ao 8º dia de cultivo (LN1-8). A inibição foi prejudicial a partir do 4º dia de cultivo (grupos LN4-8 e LN1-8), ao reduzir as taxas de eclosão (17,3%±13,44 e 13,7%± 14,51, respectivamente, p<0,05). Entretanto, o efeito mais negativo ocorreu do 1º ao 8º dia (LN1-8) em que a taxa de blastocisto foi significativamente menor comparada ao controle (29,4%±3,72 vs 47,8%±11,34, respectivamente, p<0,05). Por isso no experimento 2, a ARG (1, 10 e 50mM) foi adicionada desde o 1º dia de cultivo. As taxas de blastocisto usando 1 e 10mM de ARG foram similares ao controle (48%±13,03 e 34,2%±3,92 vs 49,4%±4,82, respectivamente, p>0,05), mas 50mM prejudicou a taxa de desenvolvimento embrionário (10,7%±7,24, p<0,001). No experimento 3, ARG a 1mM foi adicionada do 5º ao 8º dia de cultivo. Foram observadas taxas de desenvolvimento similares ao grupo GLN (somente com glutamina). Mas comparada ao controle (sem ambos os aminoácidos), rendeu melhores taxa de eclosão (54,8%±6,9 vs 41,4%±11,47, respectivamente, p<0,05) e qualidade embrionária (84,8%±2,63 vs 52%±8,62, respectivamente, p<0,05), mas não de taxa de blastocisto (49,4%±6,5 vs 49,4%±4,8, respectivamente, p>0,05). Neste período a produção de NO- foi positivamente correlacionada com a taxa de eclosão (R²=96,4%, p<0,001) e a qualidade embrionária (R²=75,5%, p<0,05). Adicionalmente, embriões foram cultivados na presença de L-NAME e ARG simultaneamente (grupo ARG/LN), do 5º ao 8º dia de cultivo, e os transcritos de OCT-4 e INT-t foram quantificados por PCR tempo real. Foi encontrada expressão similar de OCT-4 (p>0,05), mas redução de 1,8x e 1,5x de INT-t em relação aos grupos controles ARG e GLUT (p<0,05), respectivamente. Esses dados fornecem evidências da contribuição do NO-, principalmente no período entre os estágios de mórula e blastocisto, para a melhoria da eclosão e qualidade embrionária. A produção de NO- é requerida para o desenvolvimento pré-implantacional de embriões bovinos produzidos in vitro, e pode ser mediada pela suplementação do meio de cultivo com ARG.

Modelo experimental de imunossupressão com ciclofosfamida em Rattus norvegicus da linhagem wistar e primatas não humanos da especie Cebus apella: análise genotoxicológica

Foi estabelecido um modelo de imunossupressão em roedores por inoculação do agente alquilante Ciclofosfamida (CY). A administração de 50 mg/kg de CY em ratos Wistar provocou uma significante diminuição dos parâmetros de celularidade e peso relativo dos órgãos linfóides. Pela análise da titulação de anticorpos, do ensaio sobre as células formadoras de placa e do teste de hemólise foi comprovada que a imunidade humoral dos roedores sofreu supressão. Foram realizadas quatro inoculações desse imunossupressor e a periodicidade entre as inoculações foi determinada pela recuperação dos níveis de normalidade dos parâmetros supracitados. A alteração na contagem diferencial de células sanguíneas brancas representou o maior efeito adverso da CY, observado nos parâmetros de laboratório analisados nos Cebus apella. Nas duas vezes que foi administrada a droga houve redução no número de linfócitos e posteriormente diminuição de neutrófilos, porém somente na segunda foi observada a imunossupressão. Visto a proximidade filogenética dos primatas não humanos, este desenho experimental será de suma importância para o estudo de tumores em diversas fases do desenvolvimento e principalmente para testes de novos fármacos e esquemas terapêuticos. Com relação às análises de genotoxicidade da CY podemos concluir que em ratos Wistar, as administrações de CY aumentaram significativamente a freqüência de micronúcleos em eritrócitos policromáticos (MN PCEs) e provocaram efeito citotóxico (P<0.05). Em C. apella, os linfócitos do sangue periférico, após o tratamento com CY apresentaram um aumento significativo da media de MN/1000 células em relação aos linfócitos controle (P<0.05). A concentração de CY de 50mg/kg, em C. apella, corresponde à concentração DL50 da droga, visto que 50% desses animais morreram durante o experimento de imunossupressão. Até o desenvolvimento deste trabalho, não se conhecia a concentração correspondente ao DL50 nessa espécie. Ao comparamos as duas espécies de animais utilizadas neste trabalho, os primatas não humanos têm uma recuperação imune mais rápida em relação aos ratos Wistar. Provavelmente a capacidade de metabolização da droga seja mais eficaz em C. apella. Nossos resultados apóiam, portanto, que os primatas não humanos constituem os melhores modelos experimentais devido a sua grande proximidade evolutiva e filogenética com o ser humano.

Cinética da enzima alfa-galactosidase a e investigação de doença de fabry em pacientes hemodialisados

A Alfa-galactosidase A (α-Gal A) humana é uma enzima lisossômica que quando deficiente causa a doença de Fabry. A doença de Fabry é uma esfingolipidose cuja principal causa de morbi-mortalidade é a insuficiência renal crônica (IRC). O objetivo deste estudo foi a implantação de um protocolo laboratorial que permita o diagnóstico da doença de Fabry em plasma e leucócitos, além da análise das características cinéticas da enzima α-Gal A em plasma e busca ativa da doença em 25 indivíduos com IRC de causa desconhecida. Também foram avaliadas a reprodutibilidade e a estabilidade do método enzimático. A padronização dos ensaios foi realizada com o substrato fluorescente 4-metilumbeliferil-α-Dgalactopiranosídeo. A reprodutibilidade foi avaliada utilizando amostras de plasma aliquotadas a 4ºC, -20ºC e -70ºC, analisadas uma vez ao mês por 6 meses e a estabilidade da fluorescência por até 24 horas após o término do ensaio enzimático. A padronização permitiu a implantação de valores de referência da α-Gal A para o estado do Pará, de 4 a 28 nmoles/h/mL (plasma) e de 20 a 96 nmoles/h/mg proteína (leucócitos). A enzima α-Gal A se mostrou termolábil, visto que com apenas 1 minuto de pré-incubação das amostras a 60ºC, sua atividade decaiu 71,09%. Com relação ao tempo de incubação, a atividade enzimática apresentou uma disposição linear crescente entre 15 a 180 minutos de incubação. A α-Gal A apresentou maior atividade no pH 4,8, o Km encontrado para a α-Gal A foi de 1,007 mM e a Vmáx foi 30,9 nmoles/h/mL. A melhor temperatura de armazenamento de plasma até o ensaio enzimático é -20ºC, onde foi observada menor variação em um período máximo de 6 meses. O método enzimático utilizado é estável, mesmo após 24 horas do término do ensaio, em temperatura ambiente. Com relação aos pacientes com IRC de causa desconhecida, todos apresentaram valor de atividade da α-Gal A dentro dos parâmetros de referência e, portanto, nenhum foi diagnosticado com doença de Fabry. O entendimento da cinética da α-Gal A e do seu comportamento in vitro possibilita um melhor diagnóstico laboratorial da doença de Fabry gerando dados para futuras comparações com indivíduos afetados por mutações nesta enzima

Expressão dos genes C-MYC, HER-2 e receptores hormonais como preditores de resposta à quimioterapia neoadjuvante em câncer mamário

O câncer de mama é um dos tumores de maior incidência na mulher, e por isso, muitas pesquisas vêm sendo realizadas, desde a avaliação das características epidemiológicas, à dinâmica biocelular e o tratamento desta doença. Na avaliação de respostas ao tratamento, os fatores preditivos são marcadores que auxiliam na escolha da melhor droga a ser usada. Esta dissertação teve o objetivo de avaliar os genes de receptores de estrogênio e progesterona, HER-2 e C-MYC em tumores localmente avançados da mama, como fatores preditivos de resposta à quimioterapia neoadjuvante. Estudaram-se fragmentos da neoplasia maligna mamária de 50 pacientes com carcinoma ductal infiltrativo, com estadiamento clínico E-III e tratadas com quimioterapia neoadjuvante. Utilizaram-se as técnicas de imunohistoquímica e de hibridização in situ por fluorescência (FISH). A análise dos receptores hormonais não apresentou diferença estatisticamente significativa comparando as pacientes com resposta satisfatória à quimioterapia, das insatisfatórias; a análise do HER-2 apresentou significância apenas para as respostas satisfatórias, onde houve baixa amplificação deste gene. Em relação ao C-MYC observou-se uma diferença estatisticamente significativa comparando a alta amplificação deste gene a uma resposta insatisfatória à quimioterapia. O estudo concluiu que o gene C-MYC pode ser um importante marcador de predição nos tratamentos quimioterápicos neoadjuvantes usados em câncer mamário.

Caracterização da cinética de captação de glutamato por cromatografia líquida de alta eficiência em tecido retiniano

O presente estudo descreve um método eficiente e simples utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) acoplada a detector de fluorescência para determinação dos parâmetros cinéticos da captação de glutamato (glu) no sistema nervoso central (SNC). O tecido retiniano embrionário de ave com sete dias de desenvolvimento foi incubado com concentrações conhecidas de glu (50-500 μM) por dez minutos. Os níveis do aminoácido derivado a partir de ortoftaldeído (OPA) no meio de incubação foram mensurados. Após avaliar a diferença entre a concentração de glu inicial e a final no meio, foi determinada a saturação do mecanismo de captação (Km = 8,2 e Vmax = 9,8 nmol/mg proteína/minuto). Estas determinações foram dependentes e independentes de sódio e temperatura, indicando que o mecanismo que regula a diminuição dos níveis de glu no SNC, é a captação via transportadores de alta afinidade. Além disso, o cloreto de zinco (ZnCl) (um inibidor do transportador glu/aspartato) foi utilizado em diversas concentrações e evocou diminuição da captação de glu. Com isto, destaca-se a elevada aplicabilidade desta metodologia. Além deste trabalho caracterizar metodologia alternativa para avaliar captação de glu no SNC usando CLAE, também pode ser importante ferramenta para estudos relacionados à caracterização do transporte do neurotransmissor durante injúrias no SNC.